دانلود مقاله اثر القایی IDE1 در تمایز سلولهای بنیادی القا شده انسانی به سلولهای آندودرم قطعی با استفاده از داربست نانوفیبر PCL در word دارای 15 صفحه می باشد و دارای تنظیمات در microsoft word می باشد و آماده پرینت یا چاپ است
فایل ورد دانلود مقاله اثر القایی IDE1 در تمایز سلولهای بنیادی القا شده انسانی به سلولهای آندودرم قطعی با استفاده از داربست نانوفیبر PCL در word کاملا فرمت بندی و تنظیم شده در استاندارد دانشگاه و مراکز دولتی می باشد.
این پروژه توسط مرکز مرکز پروژه های دانشجویی آماده و تنظیم شده است
توجه : در صورت مشاهده بهم ریختگی احتمالی در متون زیر ،دلیل ان کپی کردن این مطالب از داخل فایل ورد می باشد و در فایل اصلی دانلود مقاله اثر القایی IDE1 در تمایز سلولهای بنیادی القا شده انسانی به سلولهای آندودرم قطعی با استفاده از داربست نانوفیبر PCL در word ،به هیچ وجه بهم ریختگی وجود ندارد
بخشی از متن دانلود مقاله اثر القایی IDE1 در تمایز سلولهای بنیادی القا شده انسانی به سلولهای آندودرم قطعی با استفاده از داربست نانوفیبر PCL در word :
مقدمه
امروزه گسترش بسیاری از بیماریها ازجمله بیماریهای دستگاه گوارش، دیابت و سیروز کبدی در جوامع انسانی خطری جدی قلمداد میشود. دانشمندان از گذشته تا به حال بهدنبال راههای مؤثر برای درمان اینگونه بیماریها بودهاند و به موفقیتهای چشمگیری دست یافتهاند. در سالهای اخیر، سلولدرمانی به منزله روشی مؤثر برای درمان بسیاری از بیماریها هدف توجه قرار گرفته است. سلولهای بنیادی جنینی، سلولهای بنیادی مغز استخوان، سلولهای بنیادی خون بند ناف و برخی سلولهای بنیادی آندودرمی و اکتودرمی به مثابه گزینههایی برای درمان این بیماریها پیشنهاد شدهاند. سلولهای جنینی بهعلت امکان رد پیوند، مشکلات اخلاقی و امکان تولید تومور در بدن فرد دریافتکننده وهمچنین سلولهای بنیادی مغز استخوان بهدلیل محدودیتهای مختلف ازجمله تبدیل به سلول استئوکلاست، ازدستدادن قدرت تمایز در سنین بالا، تولید جمعیت سلولی بسیار متنوع و غیره گزینه های مناسبی به شمار نمیآیند (Sethe et al., 2006; Lu et .al., 2006) بهدنبال بحث تولید سلولهای iPS
(Induced pluripotent stem cells) از سلولهای تمایزیافته بالغ توسط Yamanaka دریچه جدیدی از امید برای بهکار بردن سلولهای بنیادی در درمان بیماریها
بدون نگرانی از وجود مشکلات دستگاه ایمنی و مسائل اخلاقی باز شده است (Maruyama et al., 2013;
.Yamanaka, 2009)
سلولهای iPS سلولهای بنیادی پرتوانی تلقی میشوند که به طور آزمایشگاهی از سلولهای غیربنیادی بالغ به دست میآیند (Noguchi, 2009; Kim et al., . 2008b) بدینصورت که ژنهای القاکنندهای که شامل ژنهای خانوادههای Oct، Sox، Klf و Myc هستند با کمک روشهای مختلف مثل استفاده از سیستم لنتی-ویروس وارد سلولهای بالغ میشوند (Takahashi &
.Yamanaka, 2006) سلولهای iPS توانایی خودنوزایی و تمایز به انواع سلولهای بدن انسان را دارند و از بسیاری جهتها ازجمله مورفولوژی، سرعت تکثیر، فعالیت تلومرازی و بیان انواع ژنهای پرتوانیکاملاً، مشابه سلولهای بنیادی جنینی عمل میکنند ( Zaehres & .(Scholer, 2007 امروزه محققان به این مهم دست یافتهاند که تمایز سلولهای بنیادی پرتوان به سلولهای آندودرم قطعی اولین و مهمترین مرحله در تمایز سلولهای بنیادی به سلولهایی مانند سلولهای پانکراسی یا هپاتوسیتی است .(Sherwood et al., 2007) آندودرم قطعی منشأ دودمانهای سلولی اپیتلیالی است که برخی مسیرهای تنفسی و گوارشی را ایجاد میکند و منشأ
یافتههای نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
تیروئید، تیموس، ششها، کبد و پانکراس نیز هست .(D’Amour et al., 2005) آندودرم قطعی در طول مرحله گاسترولاسیون جنینی تشکیل میشود، فرآیندی که سلولهای پرتوان اپیبلاستی درون توده سلولی داخلی به سه لایه زاینده اولیه تقسیم میشوند. سلولهای اپیبلاستی یکی از دو نوع سلولهایی هستند که در توده داخلی وجود دارند و منشأ بافتهای جنینی میگردند. دسته دیگر سلولهای هیپوبلاستی هستند که منشاء بافتهای خارج جنینی مثل آندودرم احشایی و آندودرم محیطی میشوند که در تشکیل حفرههای جنینی شرکت میکنند، اما شواهدی برای شرکت آنها در تکوین بافتهای جنینی وجود ندارد .(Zhou et al., 2008)
آغاز گاسترولاسیون با ظهور خط اولیه تعیین میشود؛ جایی که سلولهای اپیبلاستی از آنجا وارد و ازحالت اپیتلیالی به مزانشیمی تبدیل میشوند تا آندودرم قطعی یا مزودرم را ایجاد کنند. مطالعات نشان میدهد که این سلولها از پیشسازهای مشترکی تکوین مییابند که در-واقع سلولهای حد واسطی محسوب و مزواندودرم نامیده میشوند .(Hansson et al., 2009) بعد از آشکارشدن اهمیت تولید سلولهای آندودرم قطعی، پروتکلهای مختلفی برای القای انواع سلولهای بنیادی به سلولهای اندودرم قطعی با استفاده از انواع سیگنالینگهای مولکولی مطرح شد. ازجمله رایجترین و مؤثرترین فاکتورهای القاکننده میتوان به Activin A با غلظتهای بالا و Nodal اشاره کرد ( Kroon et al., 2008; McLean et al., 2007; D’Amour et al., 2006) که ازطریق فعالکردن مسیرهای Smad عمل میکنند و سبب القا سلولهای آندودرم قطعی با کارایی بالا میشوند .(Mfopou et al., 2010) یکی دیگر از فاکتورهای مؤثر،که امروزه در القای سلولهای آندودرم قطعی استفاده
10 Nova Biologica Reperta 1: 8 -22 (2015)
10/
میشود، ریزمولکولی با عنوان IDE1 مخفف Induced definitive endoderm میباشد که بهدلیل مزیتهایی که نسبت به عوامل دیگر دارد مرکز توجه است. مطالعات اخیر نشان داده که IDE1 نیز ازطریق فعالسازی مسیر Smad عمل میکند .(Borowiak et al., 2009)
در سالهای اخیر، مهندسی بافت به منزله یک رشته-ای آکادمیک فرصت بینظیری را برای پیشرفت و بهبود روشهای درمانی جهت درمان بیماریهای مادرزاد و اکتسابی فراهم کرده است .(Serra et al., 2013) مطالعات نشان میدهد استفاده از داربست نقش مؤثری در تمایز سلولهای بنیادی به انواع مختلف سلولها دارد و سبب افزایش بقا و تکثیر آنها میشود. وضعیت کشت سهبعدی در مقایسه با کشت دوبعدی به وضعیت تکوین در in vivo شبیهتر است. داربستهای نانوفیبروز با تشکیل شبکهای از الیاف بهمتنیدهشده با منافذ فراوان، فضایی شبیه به ماتریکس خارج سلولی بدن برای سلولها فراهم میسازد که بر مورفولوژی، جهتگیری، چسبندگی، مهاجرت، تکثیر، تمایز و عملکرد سلولها مؤثر است .(Hosoya et al., 2012) امروزه استفاده از داربستهای مصنوعی بهعلت مزیتهای فراوان ازجمله انعطافپذیری و قیمت مناسب بهشدت درحال گسترش است
.(Domingos et al., 2013; Meng et al., 2006) ازجمله مهمترین و معمولترین داربستهای بهکاررفته میتوان به PLA, PCL, PGA و PLGA اشاره کرد
(Chao et al., 2009; Kim et al., 2008; Pham et . al., 2006) هدف این تحقیق بررسی توان تمایز
سلولهای hiPS در محیط کشت سهبعدی به سلولهای آندودرم قطعی با استفاده از IDE1 بهوسیله بررسی مارکرهای آندودرمی بوده است.
یافتههای نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
مواد و روشها
کشت سلولهای hiPS
سلولهای hiPS به صورت معمول بر روی سلولهای فیبروبلاست موشی، که یک لایه سلولی تغذیه کننده
محسوب میشوند، در محیط کشت DMEM/F12
(Gibco) حاوی 10 Serum Knock Out
(SR, Gibco) Replacement، 5 Fetal Bovine (FBS, Gibco) Serum، ال-گلوتامین با غلظت 2 میلیمولار (Gibco)، بتامرکاپتواتانول (Gibco) با غلظت 1/1 میلیمولار، اسیدهای آمینه ضروری (Sigma) با غلظت یک میلیمولار، پنیسیلین 1 (Gibco) و (Gibco) bFGF با غلظت 10 ng/ml در فلاسک کشت داده شدند. محیط کشت سلولی بهصورت روزانه تعویض ومعمولاً بعد از 8 روز با استفاده از کلاژناز نوع چهار (Sigma) با غلظت 1 mg/ml پاساژ داده شدند.
تمایز سلولهای hiPS به سلولهای آندودرم قطعی
بعد از این که حدود 80 فلاسک پر شد، سلولها پاساژ و از سلولهای تغذیهکننده جدا شدند و حدود 5×104 سلول در ظروف ششخانه نچسب به مدت 2 تا 4 روز همراه با محیط کشت کامل قرار داده شدند تا اجسام جنینی (EBs) شکل بگیرند. سپس سلولها با محیط کشت DMEM/F12 حاوی 10 SR، 5 FBS، ال-گلوتامین با غلظت 2 میلیمولار، بتامرکاپتواتانول با غلظت 1/1میلی مولار، اسیدهای آمینه ضروری با غلظت یک میلیمولار، پنیسیلین 1 و ماتریژل 1 (R&D) بر روی داربست قرار گرفتند و 24 ساعت بعد این محیط با محیط کشت تمایزی DMEM/F12 حاوی 0/2 SR، الگلوتامین با غلظت 2 میلیمولار، بتامرکاپتواتانول با غلظت 1/1 میلیمولار، اسیدهای آمینه ضروری با غلظت یک میلیمولار، پنیسیلین 1 و (Stemgent) IDE1 با
11 Nova Biologica Reperta 1: 8 -22 (2015)
11/
غلظت 1 µM جایگزین شد. محیط تمایزی هر 48 ساعت یکبار تعویض و سلولها بهمدت یک هفته در این وضعیت نگهداری شدند.
تهیه داربست نانوفیبری با روش الکترواسپینینگ
برای تهیه داربست ابتدا پلیمر (Sigma) PCL با غلظت 10 در حلال کلروفورم در دمای اتاق به مدت 24 ساعت حل شد تا محلولی شفاف بهدست آمد. سپس محلول در سرنگ پلاستیکی 5 میلیلیتری قرار گرفت و در دستگاه الکترواسپینینگ جاسازی شد. برای اسپین این محلول از سوزن 22 gauge استفاده شد. ولتاژ بین 12 تا 14 کیلوولت، سرعت تزریق 0/5 میلیلیتر در ساعت، فاصله سر سوزن تا غلتک 10 سانتیمتر و سرعت چرخش غلتک 1000 rpm تنظیم شد. این محلول به مدت 15 ساعت روی ورقه الومینیومی اسپین شد و سپس اسکافولد حاصل بهمدت 24 ساعت در خلأ خشک شد.
کشت سلولهای hiPS بر داربست
بعد از تهیه، داربست به قطعاتی با قطر 16 میلیمتر تقسیم و برای استریلشدن به مدت 24 ساعت درمقابل تابش امواج UV قرار داده شد؛ سپس در پلیت 24 خانه تعبیه و بهمدت 24 ساعت در PBS محتوی غلظت بالای پنیسلین-استرپتومایسین قرار گرفت. سپس تعداد 5×104 cell/well سلول در هر خانه ریخته شد و برای افزایش چسبندگی سلولی از غلظت 1 ماتریژل استفاده شد و 24 ساعت بعد محیط تمایزی اضافه گردید.
بررسیهای مورفولوژی با میکروسوپ الکترونی
مورفولوژی، قطر و منافذ الیاف تهیهشده و همچنین چگونگی آرایش سلولی بر داربست با میکروسکوپ الکترونی (SEM) بررسی شد. برای آمادهسازی نمونه
TaqMan Reverse
یافتههای نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
اسکافولدهای دارای سلول ابتدا نمونهها با PBS بهمدت پنج دقیقه شسته شد و سپس با گلوتاردهید 2/5 به مدت یک ساعت تثبیت و سپس آبگیری با الکلهای 30، 50، 70، 80، 90، 100 به صورت صعودی هر کدام پانزده دقیقه انجام گرفت. سپس با ذرات طلا پوشانده شد و عکسبرداری با میکروسکوپ الکترونی SEM انجام گرفت. قطر الیاف و اندازه منافذ با استفاده از نرمافزار Measurement اندازهگیری شد.
ارزیابی میزان بقای سلولی با روش MTT
میزان بقای سلولهای کشتدادهشده روی داربست نانوفیبروز در مقایسه با محیط کشت دوبعدی (محیط تمایزی کشت دوبعدی کاملاً مشابه محیط تمایزی کشت سهبعدی است و فقط در این مرحله داربست وجود ندارد) با استفاده از MTT با غلظت 5 mg/ml ارزیابی شد. این آزمون در روزهای 1، 3 و 5 بعد از قراردادن سلولها در محیط کشت دوبعدی و سهبعدی انجام شد. به این صورت که در زمان مناسب بعد از کشت سلولها در پلیتهای 24 خانه، محیط کشت خارج و به هر خانه حدود 300 میلیلیتر محیط تازه حاوی 30 میکرولیتر از محلول MTT اضافه شد. بعد از 3 تا 4 ساعت انکوباسیون با دمای 37 درجه سانتیگراد محلول MTT خارج و به هر خانه 200 میکرولیتر DMSO (Dimethyl Sulfoxide) اضافه شد. سپس جذب نمونه در طول موج 570 با استفاده از دستگاه الیزا ریدر خوانده شد.
بررسی ایمونوسیتوشیمی
یکهفته بعد از تیمار، سلولهای تمایزیافته با پارافرمالدهید 4 (PFA, Sigma-Aldrich) بهمدت 30 دقیقه تثبیت شدند. سپس با PBS شسته شدند و به وسیله TX-100 in 0/1 PBS (TBST) نفوذپذیر و سپس به مدت یک
12 Nova Biologica Reperta 1: 8-22 (2015)
12/
ساعت در محلول بلوکینگ (5% BSA in TBST) قرار گرفتند. سپس بهمدت 12 ساعت در معرض آنتیبادیهای اولیه شامل (Santa cruz) Sox17، (R&D) Gsc و (Millipore) FoxA2 قرار گرفتند. در مرحله بعد سلولها تحت شستشو قرار گرفتند و سپس به مدت یک ساعت در مجاورت آنتیبادیهای ثانویه شامل Alexa
fluor 488 و (Gibco) Alexa fluor- 594 قرار گرفتند و بعد از شستشو، برای رنگآمیزی هستهها، با رنگ DAPI به مدت 5 دقیقه رنگآمیزی شدند.
استخراج RNA و انجام qRT-PCR
الگوی بیان mRNA ژنهای مختلف درگیر در تکوین آندودرم قطعی با استفاده از qRT-PCR انجام شد. برای استخراج RNA سلولها با استفاده از Qiazol لیز شدند و
برای سنتز cDNA از
Transcription Kit (ساخت شرکت کیاژن، ژاپن) استفاده شد. برای هر نمونه 40 نانوگرم از cDNA سنتز –
شده با 10 میکرولیتر از Power Syber Green master mix (ساخت شرکت کیاژن، ژاپن) و 0/5 میکرولیتر از هر پرایمر (جدول (1 مخلوط گشت. Ct هر نمونه با استفاده از نرمافزار StepOne محاسبه و نرمالیزاسیون با استفاده از ژن HPRT انجام گرفت و هر آزمایش سه بار تکرار شد.
بررسیهای آماری
کنترل و آزمایش به صورت میانگین و انحراف از خطای میانگین محاسبه شد و برای بررسی معنیدار بودن اختلاف بین گروهها از آزمون T و نرمافزار SPSS(Ver.12) استفاده شد و تفاوت p<0.05 معنیدار در نظر گرفته شد.
یافتههای نوین در علوم زیستی، جلد 8- 22 :1
نتایج
بررسی مورفولوژی سلولهای hiPS کشت داده شده بر داربست PCL
بررسی مورفولوژی داربست PCL و چگونگی استقرار سلولهای hiPS بر داربست ازطریق عکسبرداری با میکروسکوپ الکترونی SEM انجام گرفت. میکروگراف الکترونی داربست نانوفیبروز PCL در شکل -1الف نشان
13 Nova Biologica Reperta 1: 8-22 (2015)
13/
داده شده است و متوسط قطر الیاف با نرمافزار Measurmentحدوداً 200 نانومتر تخمین زده شد (شکل-1ب). شکل 2 مبین چگونگی استقرار سلولهای hiPS بر داربست PCL پوششدادهشده با ماتریژل بعد از 7 روز است که استقرار، بقا و تمایز سلولها بر داربست را نشان میدهد.
اشتراک‌گذاری:
- ۹۵/۰۷/۱۷